清開靈、血塞通注射液類過敏反應(yīng)研究_健康_資訊_

對血塞通注射液研究.doc

李黎明+金若敏+符勝光+等

摘要：目的用RBL-2H3細胞初步評價清開靈、血塞通注射液類過敏反應(yīng)，為完善中藥注射劑類過敏反應(yīng)的篩選提供實驗依據(jù)。方法 MTT法測定2種藥物對細胞生長的IC50；采用不同濃度藥物、C48/80或培養(yǎng)液分別刺激細胞30 min，檢測上清液中組胺、β-氨基己糖苷酶釋放率；另取刺激后的細胞，觀察其脫顆粒率及超微結(jié)構(gòu)變化。取ICR小鼠進行類過敏試驗，以含伊文思藍的藥物或生理鹽水單次尾靜脈注射30 min，記錄每組耳廓藍染的動物數(shù)、藍染總耳數(shù)及耳廓伊文思藍滲出量。結(jié)果離體實驗顯示，清開靈、血塞通注射液的IC50均為12.5 μL/mL；2種藥物在較高濃度均能促進細胞釋放組胺和β-氨基己糖苷酶（P<0.05，P<0.01），呈一定劑量依賴性；形態(tài)上可見細胞表面絨毛減少，內(nèi)部空泡狀結(jié)構(gòu)增加。小鼠類過敏試驗顯示，2種藥物對動物耳藍染率均為100%、伊文思藍滲出量明顯增多（P<0.01）。離體與整體實驗結(jié)果一致。結(jié)論清開靈、血塞通注射液具有潛在的致類過敏反應(yīng)性，RBL-2H3細胞模型用于中藥注射劑類過敏性評價具有一定的參考應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：清開靈注射液；血塞通注射液；RBL-2H3細胞；類過敏反應(yīng)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.016

中圖分類號：R285.6 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2014）09-0053-05

基金項目：國家科技重大專項-重大新藥創(chuàng)制（2009ZX0902- 002、2011ZX09301-009）

通訊作者：金若敏，E-mail：rmj801@126.com

在迄今中藥注射劑的不良反應(yīng)報道中，嚴(yán)重的不良反應(yīng)以過敏反應(yīng)表現(xiàn)為主。在已報道的過敏反應(yīng)中，不排除其中有相當(dāng)一部分為類過敏反應(yīng)所致，而目前在類過敏反應(yīng)評價實驗中，多以整體實驗為主。在離體實驗中，肥大細胞是過敏反應(yīng)和類過敏研究中主要效應(yīng)細胞之一。RBL-2H3細胞表面表達高親和力的IgE受體，能模擬肥大細胞的多種生物功能，在免疫性或非免疫性刺激下，RBL-2H3細胞均具有脫顆粒特性，因此，常用于與肥大細胞脫顆粒相關(guān)研究[1]。本研究以臨床常用的清開靈注射液、血塞通注射液為主要研究藥物，考察藥物細胞毒作用及對細胞脫顆粒的影響，并結(jié)合動物整體研究結(jié)果，進一步對該細胞用于中藥注射劑類過敏評價中的可行性進行研究。

1 實驗材料

1.1 動物與細胞

清潔級雄性ICR小鼠，體質(zhì)量24～27 g，購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK （滬）2008-0016，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。RBL-2H3細胞，購于中國科學(xué)院細胞資源中心，以含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、95%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，每3 d以1∶3稀釋傳代培養(yǎng)1次。

1.2 藥物與配制

清開靈注射液（以下簡稱“清開靈”），10 mL/支，河北某藥業(yè)有限公司，批號0907046；血塞通注射液（以下簡稱“血塞通”），規(guī)格100 mg/支，昆明某藥業(yè)有限公司，批號09FJ21；Compound48/80（C48/80， Sigma公司，C2313-100MG）。

細胞實驗藥物配制：清開靈或血塞通各1支，用培養(yǎng)液或臺式稀釋液稀釋至所需濃度即可。

小鼠耳廓藍染實驗藥物配制：取清開靈1支，用生理鹽水稀釋，再與0.8%伊文思藍等體積混合后，得到含0.4%伊文思藍的濃度為2.4、0.3、0.15 mL/mL清開靈藥物稀釋液，即為清開靈高、中、低劑量組；取血塞通1支（2 mL），用生理鹽水稀釋，再與0.8%伊文思藍等體積混合后，即得到含0.4%伊文思藍的濃度為24.0、3.0、1.5 mg/mL的血塞通藥物稀釋液，即為血塞通高、中、低劑量組；稱取5 mg C48/80，用10 mL生理鹽水溶解，得0.5 mg/mL C48/80母液，再與0.8%伊文思藍等體積混勻，得含0.4%伊文思藍的0.25 mg/mL C48/80溶液，作為C48/80組受試藥物；空白對照組直接給予含有0.4%伊文思藍的生理鹽水。根據(jù)產(chǎn)品說明書，清開靈靜脈滴注臨床推薦劑量為20～40 mL/d，以10%葡萄糖注射液200 mL或生理鹽水注射液100 mL稀釋后使用。血塞通靜脈注射臨床推薦劑量為200～400 mg/次，以5%～10%葡萄糖注射液或生理鹽水250～500 mL稀釋后緩緩滴注，每日1次。因此本實驗設(shè)計的中藥注射劑高、中、低劑量組分別相當(dāng)于臨床推薦等效劑量上限的8倍、臨床推薦劑量范圍的上限、臨床推薦劑量范圍的下限。

1.3 試劑與配制

高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，批號1290007），胎牛血清（HycLone公司，批號SV30087.02），雙抗（Gibco，批號J112061），噻唑藍溶液（MTT，Sigma，批號M2128），TritonX-100（北京鼎國生物，批號AR-0341），組胺試劑盒（Sigma公司，純度≥99.0%），β-氨基己糖苷（Sigma公司，批號129K5008），伊文思藍（國藥集團，批號WC20080125）。

培養(yǎng)液配制：取1包高糖DMEM培養(yǎng)基粉末加入到1000 mL超純水中，并加入1.5 g碳酸氫鈉粉，攪拌均勻調(diào)整pH至7.2，用0.22 μm濾膜過濾除菌后，加入雙抗至濃度為100 U/mL，再加入胎牛血清濃度至15%。臺式緩沖液：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，

glucose 5.6 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，

HEPES 20 mmol/L，BSA 1 g，pH 7.4。

MTT溶液配制：MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸緩沖液（PBS），用0.22 μm濾膜過濾，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?

1.4 主要儀器

Thermo細胞培養(yǎng)箱，BioTek全自動酶標(biāo)儀， TPL-40B水平低速離心機，OLympus倒置系統(tǒng)顯微鏡，西格瑪2-16K冷凍離心機。

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)均用—x±s表示，方差齊者組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；小鼠耳廓藍染平均評分統(tǒng)計分析采用非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 IC10、IC50和IC80檢測

取對數(shù)生長的RBL-2H3細胞，調(diào)整濃度至1×105/mL，以100 μL/孔接種于96孔板中，每孔補足培養(yǎng)液80 μL，即每孔總體積為180 μL。設(shè)空白組、不同濃度清開靈或血塞通藥物組，每組設(shè)4個復(fù)孔。RBL-2H3細胞培養(yǎng)24 h后，藥物組加入培養(yǎng)液稀釋的清開靈或血塞通，空白組加入等體積培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，室溫下1200 r/min離心5 min，棄上清液，加入200 μL培養(yǎng)液及5 mg/mL MTT溶液20 μL，4 h后室溫離心，棄上清液，加入150 μL MTT溶解液（含10%SDS及50%N，N-二甲基甲酰胺），37 ℃溶解過夜，于570 nm處測OD值，計算抑制率[（空白組OD值-實驗組OD值）÷空白組OD值×100%]。結(jié)果顯示，清開靈和血塞通的IC80、IC50、IC10分別為50、12.5、1.56 μL/mL和33.3、12.5、3.33 μL/mL。

2.3 清開靈、血塞通對RBL-2H3細胞脫顆粒的影響

2.3.1 組胺及β-氨基己糖苷酶的釋放取對數(shù)生長的細胞，調(diào)整濃度至1×105/mL，1 mL/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后。棄上清液，用臺式緩沖液清洗，避免培養(yǎng)液顏色干擾。每孔加入臺式緩沖液360 μL，設(shè)空白組、C48/80組、不同濃度清開靈和血塞通中藥組、總酶組，每組設(shè)3個復(fù)孔。C48/80組加入C48/80 40 μL （終濃度為80 μg/L）；中藥組分別加入40 μL的含清開靈和血塞通的臺式稀釋液，使各孔中藥物終濃度分別為其IC80、IC50、IC10，空白組加入等容積的臺式緩沖液，總酶組加入等容積的0.5%TritonX-100。置于培養(yǎng)箱中30 min，取上清液，4 ℃、2000 r/min離心10 min， -20 ℃儲存，用于檢測組胺及β-氨基己糖苷酶釋放率。

取200 μL待測細胞上清液加到含200 μL三蒸水中，加入50 μL 0.4 moL/L NaOH和10 μL鄰苯二甲醛（OPT），混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，用50 μL 0.1 moL/L鹽酸終止反應(yīng)，用熒光酶標(biāo)儀于吸收光349 nm和發(fā)射光448 nm測定熒光值。以熒光強度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的組胺量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖或標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出被測量樣品組胺濃度（ng/mL），計算釋放率[（實驗孔上清液組胺含量÷總酶孔上清液組胺含量）×100%]。

取各孔細胞上清液50 μL轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中，同時加入50 μL底物（1 mmol/L β-氨基己糖苷的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.5），37 ℃孵育60 min，最后加入200 μL終止液（0.1 mmol/L Na2CO3/NaHCO3，pH 10.0）終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀405 nm處測OD值[2]，計算釋放率[（實驗孔上清液OD值÷總酶孔上清液OD值）×100%]。

結(jié)果顯示，與空白組比較，C48/80能引起細胞明顯釋放β-氨基己糖苷酶、組胺（P<0.01）；血塞通、清開靈在IC80、IC50時β-氨基己糖苷酶、組胺釋放明顯增多（P<0.05，P<0.01）。清開靈在IC10可促組胺釋放，兩者比較，清開靈致細胞脫顆粒釋放介質(zhì)能力更強，見表1。

2.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

2.3.2.1 甲苯胺藍染色另取細胞，按照上述“2.3.1”項下實驗過程中操作，每組3個復(fù)孔，分別加入C48/80、不同濃度清開靈和血塞通30 min后，棄上清液，加入1 mL含10%甲醛溶液的PBS室溫固定10～15 min，棄固定液后，加入1 mL 1%甲苯胺藍染色液室溫染色10 min，棄染色液，顯微鏡下（×40倍）計數(shù)，每孔按“#”分成9個計數(shù)視野區(qū)域，隨機計數(shù)其中3個視野區(qū)域，記錄視野下細胞總數(shù)及脫顆粒細胞總數(shù)。脫顆粒細胞判定標(biāo)準(zhǔn)：正常細胞染色均勻，呈藍色，邊緣完整；脫顆粒細胞染色不均，呈藍紫色，細胞膨脹或邊緣破裂。計算脫顆粒率（脫顆粒細胞數(shù)÷視野下細胞總數(shù)×100%），相對脫顆粒倍數(shù)=藥物組細胞脫顆粒率÷空白組細胞脫顆粒率。結(jié)果顯示，與空白組比較，C48/80、清開靈及血塞通的IC10即可引起細胞明顯脫顆粒（P<0.01），并呈一定的劑量依賴性。從相對脫顆粒倍數(shù)來看，清開靈和血塞通比較，以清開靈致細胞脫顆粒作用較強，見表1。

2.3.2.2 透射電鏡觀察取對數(shù)生長期的細胞，按照“2.3.1”項細胞濃度直接培養(yǎng)在10 cm直徑培養(yǎng)皿中，每個藥物濃度組設(shè)1皿。按照“2.3.1”項操作加入不同濃度清開靈和血塞通處理后，分別收集各皿中全部細胞，離心，取細胞團塊，用預(yù)冷的2.5%戊二醛4 ℃固定，進行透射電鏡樣本處理及超微結(jié)構(gòu)觀察。結(jié)果顯示，正常組RBL-2H3細胞表面有大量絨毛，細胞內(nèi)部有極少量空泡狀結(jié)構(gòu)；隨清開靈、血塞通濃度增加，細胞表面絨毛減少，細胞內(nèi)部空泡狀結(jié)構(gòu)增加，高劑量組部分細胞表面已無絨毛結(jié)構(gòu)，細胞膜不完整，甚至破裂。

2.4 小鼠類過敏試驗

參照文獻[3]，將ICR小鼠隨機分為清開靈高、中、低劑量組和血塞通高、中、低劑量組及空白組、C48/80組，每組10只。記錄每只小鼠體質(zhì)量；各組小鼠尾靜脈注射給予生理鹽水稀釋的含小鼠有0.4%伊文思藍的受試藥物，給藥體積為20 mL/kg，觀察給藥后30 min內(nèi)動物耳廓藍染情況，記錄每組出現(xiàn)耳廓藍染的動物數(shù)、藍染總耳數(shù)、耳廓藍染面積，進行耳廓藍染面積評分。0分：雙耳無藍染；1分：0<藍染面積≤1/8；2分：1/8<藍染面積≤1/4；3分：1/4<藍染面積≤1/2；4分：1/2<藍染面積≤3/4；5分：3/4<藍染面積≤1。處死動物，取雙耳，剪碎，用2 mL丙酮-生理鹽水（7∶3）混合浸泡，4 ℃過夜，3000 r/min離心15 min，取上清液200 μL于酶標(biāo)儀610 nm處測光密度值（OD值），根據(jù)伊文思藍標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算伊文思藍染料的滲出量。

結(jié)果顯示，C48/80組小鼠藍染率為90%，清開靈各劑量組小鼠藍染率均為100%，與空白組比較平均得分明顯增加（P<0.01）；血塞通高、中劑量組小鼠藍染率為100%，血塞通低劑量組藍染率為80%，除血塞通低劑量組外各組平均得分明顯增加（P<0.01）。C48/80組、清開靈各劑量組、血塞通各劑量組使小鼠耳廓伊文思藍滲出量明顯增多（P<0.01）。

血塞通組（低）

3 討論

一般認(rèn)為，類過敏反應(yīng)不經(jīng)IgE介導(dǎo)，在患者首次用藥即可產(chǎn)生，其發(fā)生可能與致敏物質(zhì)直接刺激肥大細胞釋放組胺等炎性介質(zhì)有關(guān)[4]，因此，肥大細胞是類過敏反應(yīng)發(fā)生中的重要效應(yīng)細胞之一，RBL-2H3細胞具有肥大細胞的特征，其在中藥注射劑類過敏反應(yīng)研究中應(yīng)用越來越受到研究者的關(guān)注。

現(xiàn)代研究表明，清開靈能致Beagle犬產(chǎn)生明顯類過敏癥狀及血清組胺含量升高，引起清開靈類過敏反應(yīng)的物質(zhì)可能與梔子提取物、黃芩苷、膽酸有關(guān)，而金銀花、梔子中均含有綠原酸，但高純度的綠原酸并未引起B(yǎng)eagle犬產(chǎn)生相應(yīng)的類過敏反應(yīng)[5-7]。本實驗結(jié)果表明，清開靈直接刺激RBL-2H3細胞脫顆粒作用非常強，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。清開靈IC80、IC50、IC10均能引起細胞組胺釋放明顯增加，甲苯胺藍法及透射電鏡下亦能觀察到一定的細胞脫顆粒變化，因此，提示清開靈可能具有潛在致類過敏反應(yīng)性。

血塞通主要成分為三七總皂苷，現(xiàn)代研究表明，血塞通所致的不良反應(yīng)主要以皮膚反應(yīng)為主，嚴(yán)重者可出現(xiàn)呼吸困難或過敏性休克等[8-9]。以不同濃度血塞通直接刺激RBL-2H3細胞可引起不同程度的細胞脫顆粒現(xiàn)象，并存在一定的劑量相關(guān)性，其中IC80、IC50均能引起細胞明顯脫顆粒釋放組胺、β-氨基己糖苷酶，甲苯胺藍及透射電鏡下亦能觀察到一定的細胞脫顆粒變化，提示血塞通臨床使用時具有一定潛在致類過敏反應(yīng)性。

清開靈、血塞通在高于或等于臨床等效劑量下，均能一定程度上使小鼠耳廓藍染，但兩藥物產(chǎn)生耳廓藍染特點存在明顯差異。清開靈在臨床推薦等效劑量范圍內(nèi)及以上劑量均導(dǎo)致小鼠耳廓出現(xiàn)明顯藍染。本實驗進一步對清開靈的生理鹽水稀釋液pH值進行檢測，結(jié)果其pH值均在6.93～7.10范圍內(nèi)，符合規(guī)定，因此，推測本實驗中小鼠耳廓藍染情況可能由注射劑中潛在的致類過敏成分所致。血塞通只在臨床推薦的高劑量及其以上劑量時產(chǎn)生了明顯致小鼠耳廓藍染，而臨床低劑量未見明顯耳廓藍染，進一步研究發(fā)現(xiàn)其生理鹽水稀釋液pH值穩(wěn)定維持在6.19～6.22，符合規(guī)定。本研究結(jié)果提示，血塞通具有潛在的致類過敏反應(yīng)性，并且與劑量呈正相關(guān)。

根據(jù)產(chǎn)品說明書，單次靜脈給藥后清開靈在血液內(nèi)最大濃度約為6×10-3 mL/mL，本實驗中所用清開靈IC80、IC50、IC10分別為50×10-3、12.5×10-3、1.56×10-3 mL/mL（約相當(dāng)血液濃度的8、2、0.3倍），3個劑量均能刺激RBL-2H3細胞明顯釋放組胺，進一步提示在臨床應(yīng)用劑量范圍內(nèi)，清開靈具有一定的潛在類過敏反應(yīng)性。

清開靈、血塞通在其IC80、IC50下均能明顯影響細胞生長，表現(xiàn)一定的細胞毒作用，而在此濃度下2種注射液均能致RBL-2H3細胞出現(xiàn)明顯脫顆粒現(xiàn)象，因此，推測細胞脫顆粒強度除藥物本身類過敏反應(yīng)所致外，還可能與注射液的細胞毒作用有關(guān)。但在IC10時清開靈仍使細胞釋放組胺明顯增加，而血塞通未見明顯變化。關(guān)氏等[10]研究亦表明，無明顯細胞毒作用下的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物40/60（mPEG- PDLLA40/60）、吐溫80也能促進RBL-2H3細胞脫顆粒。綜合以上現(xiàn)象提示，RBL-2H3細胞脫顆粒可能會受藥物細胞毒作用影響，但仍能一定程度上反映藥物潛在的致類過敏反應(yīng)性。

綜合本實驗研究結(jié)果，清開靈、血塞通均具有一定直接刺激RBL-2H3細胞脫顆粒作用，且均能使小鼠耳廓出現(xiàn)明顯藍染，進一步說明清開靈、血塞通具有潛在致類過敏反應(yīng)性，同時提示RBL-2H3細胞在評價類過敏研究中具有一定的參考應(yīng)用價值。此外，本研究表明，RBL-2H3細胞脫顆粒可能會受藥物細胞毒作用影響，但仍能一定程度上反映藥物潛在的類過敏反應(yīng)性，因此建議研究時采用IC10以下濃度并參考臨床劑量，設(shè)多個濃度組，既能減少藥物毒性對細胞脫顆粒的影響，又能為臨床應(yīng)用提供一定的參考。

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（收稿日期：2014-01-24；編輯：華強）