黃芪甲苷黃芪多糖
張秋海+丁家欣+李樹莉+劉泓+彭春龍
摘要：目的 通過不同生長年限黃芪藥材中黃芪甲苷和黃芪多糖的含量比較，為選擇黃芪的適宜采收時間提供依據(jù)。方法 采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法測定黃芪甲苷含量，色譜柱為Hypersil-Keystone C18，流動相為乙腈-水（33∶67），流速1 mL/min，漂移管溫度105 ℃，空氣流速2.7 L/min。采用苯酚-硫酸比色法測定黃芪多糖含量，測定波長490 nm。結(jié)果 黃芪甲苷的線性范圍為1.25～6.28 ?g，平均回收率為97.28% （RSD=1.42%）；黃芪多糖的線性范圍為10～100 ?g，平均回收率為99.02%（RSD=0.94%）。生長1年以上黃芪中黃芪甲苷含量均符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，生長3年者黃芪甲苷含量最高；生長3年者黃芪多糖含量最高，2年者稍低。結(jié)論 從黃芪甲苷和黃芪多糖的含量綜合來看，適宜采收的黃芪生長年限至少為2年。
關(guān)鍵詞：黃芪；黃芪甲苷；黃芪多糖；含量測定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.11.024
中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2014）11-0079-04
黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membramacens （Fisch.） Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao或膜莢黃芪A. membramacens （Fisch.） Bge.的干燥根，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生
基金項目：國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項（國中醫(yī)藥科2006ZX02）
通訊作者：丁家欣，E-mail：dingjiaxin06@126.com
肌等功效[1]。黃芪甲苷和黃芪多糖是黃芪最重要的有效成分，具有廣泛的藥理作用[2-6]。黃芪在我國分布很廣，許多地方均有種植。本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）測定黃芪甲苷含量，苯酚-硫酸比色法測定黃芪多糖含量，通過比較不同生長年限黃芪中2種成分的含量，為選擇適宜的采收時間提供依據(jù)。
1 儀器與試藥
美國HP1100高效液相色譜儀（G1311A四元泵，G1313A自動進樣器，G1316A柱溫箱，HP化學(xué)工作站），美國Alltech 2000蒸發(fā)光散射檢測器，XWK-Ⅲ無油無音空氣泵（天津市分析儀器廠）；UV8453型紫外-可見分光光度計（美國安捷倫科技有限公司）；SARTARIUS BT25S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（GSY-Ⅱ型，北京市醫(yī)療設(shè)備廠）。
不同生長年限黃芪藥材采自山西省五寨縣，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所何希榮老師鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao的根部，除去須根及根頭，洗凈，切片，晾干。
黃芪甲苷（批號0781-200109）、無水葡萄糖（批號110833-200503）對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純（J.T.baker）；甲醇，正丁醇，乙醇、苯酚、硫酸、無水乙醇均為分析純（北京化學(xué)試劑公司）；超純水由Millipore超純水系統(tǒng)制備。
2 方法與結(jié)果
2.1 黃芪甲苷含量測定
2.1.1 色譜條件 采用Hypersil-Keystone C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（33∶67）；流速1 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)：漂移管溫度105 ℃，空氣流速2.7 L/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。黃芪甲苷的保留時間約為14 min。色譜圖見圖1。
2.1.2 對照品溶液的制備 取干燥至恒重的黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.314 mg的溶液。
2.1.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液4、8、10、15、20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以對照品進樣量的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，對照品峰面積的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1.5475X+4.7489，r=0.9996，線性范圍為1.25～6.28 μg，
2.1.4 供試品溶液的制備 取黃芪藥材粉末（過4號篩）約4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流提取4 h，提取液回收甲醇并濃縮至干，殘渣加水10 mL微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。
2.1.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液10 μL，在所確定的色譜條件下，連續(xù)進樣5次，測得黃芪甲苷峰面積RSD=1.33%，表明精密度良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（編號WZ-09）10 μL，分別于制備0、2、4、8、12、24 h依次進樣，測得黃芪甲苷峰面積RSD=2.42%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.1.7 重復(fù)性試驗 取黃芪藥材（編號WZ-09）粉末5份，每份4 g，精密稱定，按“2.1.4”方法處理后，在所確定的色譜條件下進行測定。RSD=2.01%，表明方法的重復(fù)性良好。
2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知黃芪甲苷含量（0.098%）樣品（編號WZ-09）6份，每份2 g，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液（0.211 3 mg/mL）各1 mL，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液并按上述色譜條件測定，結(jié)果見表1。
2.2 黃芪多糖含量測定
2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。
2.2.2 苯酚液的配制 取苯酚100 g，加鋁片0.1 g 和碳酸氫鈉0.05 g，常溫蒸餾，收集182 ℃餾分。所得新餾苯酚用水配成5%苯酚水溶液（棕色瓶保存）。
2.2.3 最大吸收波長的選擇 精密吸取葡萄糖對照品溶液60 μL，置于10 mL具塞試管中，加水定容至2 mL，另取2.0 mL蒸餾水作空白對照，精密加入1 mL苯酚液，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，靜置5 min，置沸水浴中反應(yīng)15 min后取出并放至室溫，于紫外分光光度計波長400～600 nm范圍內(nèi)掃描，測得最大吸收波長為490 nm。
2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取葡萄糖對照品溶液10 mL，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取稀釋后的葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，加蒸餾水使體積為2.0 mL，另取2.0 mL蒸餾水作空白對照。按“2.2.3”項下方法操作，于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.705 1C+0.002 2，r=0.999 4，葡萄糖在10～100 ?g范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
2.2.5 供試品溶液的制備 取黃芪藥材30 g，加12倍量水，煮煎3次，每次1.5 h，合并3次水煎液，濃縮至24 mL（即1∶0.8），加入95%乙醇，使含醇量為70%，靜置12 h以上，4000 r/min離心10 min，濾出沉淀，用無水乙醇洗滌2次，加水溶解，定容至30 mL，加入95%乙醇，使含醇量為80%，靜置后離心，濾出沉淀，用無水乙醇洗滌多次，水浴蒸至無醇味，加水?dāng)嚢枋钩浞秩芙猓x心，取上清液置于100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，作為供試品溶液。
2.2.6 重復(fù)性試驗 平行稱取黃芪藥材（編號WZ-09） 30 g，共6份。按“2.2.5”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下方法操作，測定吸光度，計算多糖含量，結(jié)果RSD=1.42%，表明方法重復(fù)性良好。
2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品（編號WZ-09）溶液，分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h測定吸光度，計算RSD=0.50%，表明樣品溶液在3 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量（3.45%）的“2.2.5”項下供試品溶液（編號WZ-09）1.0 mL，共6份，每份精密加入葡萄糖對照品溶液（1 mg/mL）1 mL，定容至10 mL量瓶中，按“2.2.3”項下方法操作，測定吸光度，計算回收率，結(jié)果見表2。
2.3 樣品含量測定
采用建立的樣品處理方法和測定方法測定23批黃芪中黃芪甲苷和黃芪多糖的含量。結(jié)果生長年限1年者黃芪甲苷的含量范圍在0.048%～0.096%之間，2年者在0.092%～0.128%之間，3年者在0.111%～0.205%之間，4年者在0.110%～0.195%之間，5年者在0.096%～0.198%之間。生長年限1年者黃芪多糖含量范圍在1.87%～2.45%之間，2年者在2.22%～3.61%之間，3年者在2.68%～4.24%之間，4年者在2.01%～3.44%之間，5年者在2.24%～3.94%之間。結(jié)果見表3。
2.2 黃芪多糖含量測定
2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。
2.2.2 苯酚液的配制 取苯酚100 g，加鋁片0.1 g 和碳酸氫鈉0.05 g，常溫蒸餾，收集182 ℃餾分。所得新餾苯酚用水配成5%苯酚水溶液（棕色瓶保存）。
2.2.3 最大吸收波長的選擇 精密吸取葡萄糖對照品溶液60 μL，置于10 mL具塞試管中，加水定容至2 mL，另取2.0 mL蒸餾水作空白對照，精密加入1 mL苯酚液，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，靜置5 min，置沸水浴中反應(yīng)15 min后取出并放至室溫，于紫外分光光度計波長400～600 nm范圍內(nèi)掃描，測得最大吸收波長為490 nm。
2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取葡萄糖對照品溶液10 mL，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取稀釋后的葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，加蒸餾水使體積為2.0 mL，另取2.0 mL蒸餾水作空白對照。按“2.2.3”項下方法操作，于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.705 1C+0.002 2，r=0.999 4，葡萄糖在10～100 ?g范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
2.2.5 供試品溶液的制備 取黃芪藥材30 g，加12倍量水，煮煎3次，每次1.5 h，合并3次水煎液，濃縮至24 mL（即1∶0.8），加入95%乙醇，使含醇量為70%，靜置12 h以上，4000 r/min離心10 min，濾出沉淀，用無水乙醇洗滌2次，加水溶解，定容至30 mL，加入95%乙醇，使含醇量為80%，靜置后離心，濾出沉淀，用無水乙醇洗滌多次，水浴蒸至無醇味，加水?dāng)嚢枋钩浞秩芙猓x心，取上清液置于100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，作為供試品溶液。
2.2.6 重復(fù)性試驗 平行稱取黃芪藥材（編號WZ-09） 30 g，共6份。按“2.2.5”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下方法操作，測定吸光度，計算多糖含量，結(jié)果RSD=1.42%，表明方法重復(fù)性良好。
2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品（編號WZ-09）溶液，分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h測定吸光度，計算RSD=0.50%，表明樣品溶液在3 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量（3.45%）的“2.2.5”項下供試品溶液（編號WZ-09）1.0 mL，共6份，每份精密加入葡萄糖對照品溶液（1 mg/mL）1 mL，定容至10 mL量瓶中，按“2.2.3”項下方法操作，測定吸光度，計算回收率，結(jié)果見表2。
2.3 樣品含量測定
采用建立的樣品處理方法和測定方法測定23批黃芪中黃芪甲苷和黃芪多糖的含量。結(jié)果生長年限1年者黃芪甲苷的含量范圍在0.048%～0.096%之間，2年者在0.092%～0.128%之間，3年者在0.111%～0.205%之間，4年者在0.110%～0.195%之間，5年者在0.096%～0.198%之間。生長年限1年者黃芪多糖含量范圍在1.87%～2.45%之間，2年者在2.22%～3.61%之間，3年者在2.68%～4.24%之間，4年者在2.01%～3.44%之間，5年者在2.24%～3.94%之間。結(jié)果見表3。
2.2 黃芪多糖含量測定
2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。
2.2.2 苯酚液的配制 取苯酚100 g，加鋁片0.1 g 和碳酸氫鈉0.05 g，常溫蒸餾，收集182 ℃餾分。所得新餾苯酚用水配成5%苯酚水溶液（棕色瓶保存）。
2.2.3 最大吸收波長的選擇 精密吸取葡萄糖對照品溶液60 μL，置于10 mL具塞試管中，加水定容至2 mL，另取2.0 mL蒸餾水作空白對照，精密加入1 mL苯酚液，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，靜置5 min，置沸水浴中反應(yīng)15 min后取出并放至室溫，于紫外分光光度計波長400～600 nm范圍內(nèi)掃描，測得最大吸收波長為490 nm。
2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取葡萄糖對照品溶液10 mL，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取稀釋后的葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，加蒸餾水使體積為2.0 mL，另取2.0 mL蒸餾水作空白對照。按“2.2.3”項下方法操作，于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.705 1C+0.002 2，r=0.999 4，葡萄糖在10～100 ?g范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
2.2.5 供試品溶液的制備 取黃芪藥材30 g，加12倍量水，煮煎3次，每次1.5 h，合并3次水煎液，濃縮至24 mL（即1∶0.8），加入95%乙醇，使含醇量為70%，靜置12 h以上，4000 r/min離心10 min，濾出沉淀，用無水乙醇洗滌2次，加水溶解，定容至30 mL，加入95%乙醇，使含醇量為80%，靜置后離心，濾出沉淀，用無水乙醇洗滌多次，水浴蒸至無醇味，加水?dāng)嚢枋钩浞秩芙猓x心，取上清液置于100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，作為供試品溶液。
2.2.6 重復(fù)性試驗 平行稱取黃芪藥材（編號WZ-09） 30 g，共6份。按“2.2.5”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下方法操作，測定吸光度，計算多糖含量，結(jié)果RSD=1.42%，表明方法重復(fù)性良好。
2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品（編號WZ-09）溶液，分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h測定吸光度，計算RSD=0.50%，表明樣品溶液在3 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量（3.45%）的“2.2.5”項下供試品溶液（編號WZ-09）1.0 mL，共6份，每份精密加入葡萄糖對照品溶液（1 mg/mL）1 mL，定容至10 mL量瓶中，按“2.2.3”項下方法操作，測定吸光度，計算回收率，結(jié)果見表2。
2.3 樣品含量測定
采用建立的樣品處理方法和測定方法測定23批黃芪中黃芪甲苷和黃芪多糖的含量。結(jié)果生長年限1年者黃芪甲苷的含量范圍在0.048%～0.096%之間，2年者在0.092%～0.128%之間，3年者在0.111%～0.205%之間，4年者在0.110%～0.195%之間，5年者在0.096%～0.198%之間。生長年限1年者黃芪多糖含量范圍在1.87%～2.45%之間，2年者在2.22%～3.61%之間，3年者在2.68%～4.24%之間，4年者在2.01%～3.44%之間，5年者在2.24%～3.94%之間。結(jié)果見表3。
